麻疹病毒和風(fēng)疹病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品名稱(chēng)】
通用名稱(chēng)：麻疹病毒和風(fēng)疹病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）
【包裝規格】10人份/盒，20人份/盒，50人份/盒。
【預期用途】
本品用于定性檢測咽拭子樣本中麻疹病毒(MV)和風(fēng)疹病毒(RV)核酸。
麻疹病毒是單股負鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科麻疹病毒屬。麻疹是一種由麻疹病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，臨床表現為發(fā)熱、出疹、咳嗽。
風(fēng)疹病毒是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，為單股正鏈RNA病毒，風(fēng)疹是一種由風(fēng)疹病毒引起的急性發(fā)熱出疹傳染病，臨床表現為發(fā)熱和出疹，包括先天性感染和后天獲得性感染。臨床上以前驅期短、低熱、皮疹和耳后、枕部淋巴結腫大為特征。
麻疹和風(fēng)疹均是通過(guò)呼吸道傳染，以急性發(fā)熱出疹為特征的傳染病，常出現流行或爆發(fā)，嚴重危害兒童和青少年的健康。從臨床表現上風(fēng)疹、麻疹與其它發(fā)熱出疹性疾病難以鑒別。實(shí)驗室檢測方法目前主要有病毒分離、血清學(xué)檢測、核酸檢測等。
【檢驗原理】
本品采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，以麻疹病毒和風(fēng)疹病毒基因組保守區作為擴增靶區域，設計特異性引物和探針進(jìn)行PCR擴增，在一個(gè)反應體系中定性檢測樣品是否含有麻疹病毒或者風(fēng)疹病毒核酸。本品含有內標檢測系統可監控核酸提取、反轉錄及PCR擴增過(guò)程，避免出現假陰性檢測結果。
【主要組成成分】
組份名稱(chēng) 主要成分 規格及數量（單位：支）
  10人份/盒 20人份/盒 50人份/盒
反應液A 引物、探針、dNTP、Mg2+、K+。 180μl×1 360μl×1 900μl×1
反應液B 反轉錄酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、甘油。 35μl×1 65μl×1 160μl×1
陽(yáng)性對照 含麻疹病毒和風(fēng)疹病毒特異性片段的質(zhì)粒。 20μl×1 50μl×1 100μl×1
陰性對照 經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的純化水。 500μl×1 500μl×1 500μl×1
【儲存條件及有效期】
避光-20±5℃儲存，有效期12個(gè)月。
反復凍融次數不宜超過(guò)10次，開(kāi)封后-20℃下三個(gè)月內用完。生產(chǎn)日期及失效日期見(jiàn)標簽。
【適用儀器】
ABI7500、Stratagene Mx3000P、Bio-Rad CFX96熒光PCR儀。
【樣本要求】
適用標本類(lèi)型為咽拭子。
樣本采集：將無(wú)菌棉拭子稍蘸生理鹽水，反復涂抹患者咽部數次，然后將棉拭子浸于1 mL～2 mL標本維持液（含500～1 000單位（Unit，U）/mL青霉素、500 μg/mL～1 000 μg/mL鏈霉素和2％牛血清DMEM液）或者VTM中，并反復擠壓后，棄棉拭子。
樣本采集后應及時(shí)檢測，-20±5℃保存期6個(gè)月，-70℃可以長(cháng)期保存。樣本避免反復凍融，如不可避免，反復凍融次數不宜超過(guò)5次，采用低溫運輸。
【檢驗方法】
1. 樣本處理（樣本制備區）
用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit（貨號：52904）或者本公司的核酸提取試劑盒（貨號：HT5025，備案號：粵珠械20140038號）提取RNA，按說(shuō)明書(shū)操作。
2. PCR試劑準備（試劑準備區）
從試劑盒中取出反應液A、反應液B，室溫融化后振蕩混勻，瞬時(shí)離心數秒后使用。
取N個(gè)（N=待測樣本數+陰性對照+陽(yáng)性對照）PCR反應管，每管反應液配制如下表：
反應液組份 加量（μl）/人份
反應液A 17
反應液B 3
總體積 20
將各組份充分混合后，瞬時(shí)離心數秒。
3. 加樣（樣本制備區）
向上述對應的反應管中分別加入提取的待測樣本RNA、陰性對照和陽(yáng)性對照各5μl，蓋緊管蓋，瞬時(shí)離心后轉移至擴增檢測區。
4. PCR擴增檢測（擴增檢測區）
4.1  將反應管放入熒光PCR儀進(jìn)行擴增檢測。
4.2  循環(huán)參數設定（請參照各類(lèi)儀器的操作說(shuō)明進(jìn)行設置）
步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數（次）
1 逆轉錄反應 47℃ 30min 1
2 預變性 95℃ 10min 1
3 變性 95℃ 10s 45
4 退火、延伸及收集熒光 56℃ 45s 
步驟4中56℃時(shí)熒光檢測，檢測通道：ROX / Texas Red通道為內標，FAM通道為麻疹病毒， HEX/ VIC通道為風(fēng)疹病毒。
在A(yíng)BI7500熒光PCR儀中不選ROX校正，淬滅基團選None。
4.3  結果分析
反應結束后需要通過(guò)調節Baseline的Start值、End值以及Threshold值，點(diǎn)擊Analysis自動(dòng)獲得分析結果。
【陽(yáng)性判斷值或者參考區間】
采用受試者工作曲線(xiàn)（ROC）確定本試劑盒的麻疹病毒的陽(yáng)性判斷值為Ct＜38；風(fēng)疹病毒的陽(yáng)性判斷值為Ct＜38。
【檢驗結果的解釋】
質(zhì)量控制
1. 陰性對照：無(wú)典型S型擴增曲線(xiàn)顯示；
2. 陽(yáng)性對照：FAM和HEX檢測通道均呈典型S型曲線(xiàn)且Ct值≤30，同時(shí)ROX檢測通道有
或無(wú)擴增曲線(xiàn)；
3. 以上要求需要在同一個(gè)實(shí)驗中同時(shí)滿(mǎn)足，否則本次實(shí)驗無(wú)效，需重新進(jìn)行。
結果判讀
1. 陰性結果的判讀：
如果FAM、HEX檢測通道無(wú)擴增曲線(xiàn)或Ct≥40，ROX檢測通道有擴增曲線(xiàn)，可判樣品為麻疹病毒、風(fēng)疹病毒陰性；
2. 陽(yáng)性結果的判讀：
如果FAM檢測通道有擴增曲線(xiàn)且Ct＜38，ROX檢測通道有或無(wú)擴增曲線(xiàn)，可判樣品為麻疹病毒陽(yáng)性；
如果HEX檢測通道有擴增曲線(xiàn)且Ct＜38，ROX檢測通道有或無(wú)擴增曲線(xiàn)，可判樣品為風(fēng)疹病毒陽(yáng)性；
3. 可疑結果的判讀：
如果FAM檢測通道有擴增曲線(xiàn)且38≤Ct＜40，ROX檢測通道有或無(wú)擴增曲線(xiàn)，則該樣品需要進(jìn)行復測，如復測結果FAM的Ct值仍然在38~40范圍，有明顯指數增長(cháng)期，可判樣品為麻疹病毒，否則樣品為麻疹病毒陰性。
如果HEX檢測通道有擴增曲線(xiàn)且38≤Ct＜40，ROX檢測通道有或無(wú)擴增曲線(xiàn)，則該樣品需要進(jìn)行復測，如復測結果HEX的Ct值仍然在38~40范圍，有明顯指數增長(cháng)期，可判樣品為風(fēng)疹病毒陽(yáng)性，否則樣品為風(fēng)疹病毒陰性。
【檢驗方法局限性】
1. 樣本收集、處理、運輸及保存的失誤都可能導致錯誤的結果；
2. 樣本處理時(shí)發(fā)生交叉污染，可能會(huì )出現假陽(yáng)性結果；
3. 病毒的基因突變也可能導致假陰性結果；
4. 本方法由于引物探針較多，可能形成引物二聚體導致假陽(yáng)性結果。
【產(chǎn)品性能指標】
1. 最低檢測限：麻疹病毒/風(fēng)疹病毒均為5TCID50/ml。 
2. 精密性：批內精密度變異系數≤5%，批間精密度變異系數≤5%，。
3. 特異性：本品與登革病毒、乙型腦炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV弓形蟲(chóng)、巨細胞病毒、I型單純皰疹病毒、II型單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒未見(jiàn)交叉反應，與其他病原體反應尚無(wú)實(shí)驗數據。
4. 亞型檢測能力：可檢出麻疹病毒H1a、A、B3、D8、D9型，風(fēng)疹病毒2B、1E型，其他型別尚無(wú)實(shí)驗數據。
5. 干擾性試驗：常見(jiàn)干擾物質(zhì)如青霉素、地塞米松、維生素C、撲熱息痛、血液、膿液、病毒靈在檢驗樣本中的濃度分別為20μg/ml、0.3μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、25%、25%、200mg/ml時(shí)，不會(huì )影響到樣本檢測結果。
6. 本品在臨床試驗中檢測596份咽拭子樣本，與參比方法比較：
對于麻疹檢測，靈敏度為100%、特異度為95.7%、粗一致性為97.5%。
對于風(fēng)疹檢測，靈敏度為100%，特異度為97.1%，粗一致性為97.6%。
【注意事項】
1. 本品為體外診斷試劑，操作人員應進(jìn)行專(zhuān)業(yè)培訓并具備一定的相關(guān)經(jīng)驗；
2. 為保證實(shí)驗結果的準確性和可靠性請使用已校準的移液器，實(shí)驗用具（一次性PCR反應管、吸嘴、離心管等）需選用去RNA酶處理過(guò)的產(chǎn)品；
3. 實(shí)驗需要嚴格分區進(jìn)行（試劑準備區、樣本制備區、擴增檢測區），各區物品、工作服均為專(zhuān)用，不得交叉使用，實(shí)驗后要及時(shí)進(jìn)行清潔；
4. 樣品處理必須在生物安全柜中進(jìn)行，以保護操作人員安全并防止環(huán)境污染；
5. RNA樣本應保存于-70℃冰箱中，加樣前應在室溫充分融化、混勻并瞬時(shí)離心后使用；
6. 每次實(shí)驗應設置陰性對照和陽(yáng)性對照。不同批號的試劑切勿混用，在有效期內使用試劑盒；
7. MV/RV PCR反應液A與MV/RV PCR反應液B混合后，應盡快完成實(shí)驗，否則隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)而擴增效果變差；
8. 實(shí)驗過(guò)程中佩戴一次性口罩和一次性頭套，勤換一次性薄膜手套；
9. 觸摸PCR管時(shí)切忌戴乳膠手套，防止汗液或乳膠手套上的粉末等影響熒光值檢測；
10. 反應液加入模板后應顛倒混勻，輕彈管壁去除氣泡，瞬時(shí)離心；
11. 使用過(guò)的吸嘴應打入盛有10%次氯酸鈉的廢液缸中，實(shí)驗結束后與其他廢棄物一同集中處理；
12. 擴增完畢后應小心取出PCR管放入密封袋中，嚴禁在PCR實(shí)驗室開(kāi)蓋，如果開(kāi)蓋，氣溶膠會(huì )對PCR室造成污染，實(shí)驗結果會(huì )出現假陽(yáng)性；
13. 實(shí)驗結束后應用10%次氯酸鈉或75%酒精處理工作臺和移液器，然后紫外照射30分鐘；
14. 本品涉及的待測樣本應視為具傳染性物質(zhì)，避免直接接觸身體。樣本操作和處理均需符合衛生部《微生物生物醫學(xué)實(shí)驗室生物安全通用準則》和《醫療器械管理條例》相關(guān)要求；
15. 本品的內標檢測系統僅在風(fēng)疹病毒、麻疹病毒檢測均為陰性時(shí)作為對采樣及提取效果的評價(jià)，當出現風(fēng)疹病毒、麻疹病毒陽(yáng)性時(shí)，內標出現與否不影響結果的判讀。
【標識的解釋】
                                                
  溫度限制      體外診斷醫療器械       參考使用說(shuō)明       不得二次使用
【參考文獻】
Mosquera Mdel M，de Ory F，Moreno M，Echevarria JE．Simultaneous detection of measles virus，rubella virus，and parvovirus B19 by using multiplex PCR．J Clin Microbiol，2002，40(1)：111-116．
【基本信息】
注冊人/生產(chǎn)企業(yè)名稱(chēng)：珠海經(jīng)濟特區海泰生物制藥有限公司
住所：珠海市唐家灣鎮港灣大道創(chuàng )新四路18號         郵政編碼：519085
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生產(chǎn)地址：珠海市唐家灣鎮港灣大道創(chuàng )新四路18號     郵政編碼：519085
生產(chǎn)許可證編號：粵食藥監械生產(chǎn)許20040941號
【醫療器械注冊證書(shū)編號/產(chǎn)品技術(shù)要求編號】國械注準20183400480
【說(shuō)明書(shū)核準日期及修改日期】2018.11.07